РЕАКЦІЯ ГЕНА РАННЬОЇ ФУНКЦІОНАЛЬНОЇ АКТИВНОСТІ c-fos У ПРЕФРОНТАЛЬНІЙ КОРІ ТА ПОЛІ ГІПОКАМПА СА1 НА НЕПОВНУ ГЛОБАЛЬНУ ІШЕМІЮ-РЕПЕРФУЗІЮ ГОЛОВНОГО МОЗКУ У ЩУРІВ ІЗ КИШЕЧНИМ ДИСБАКТЕРІОЗОМ

Анотація

На сьогодні як в експерименті, так і в клініці, накопичено достатньо фактів щодо композиційних змін мікробіому кишечника при інсультах. Водночас, порушення кишкового мікробіому та його метаболітів є частиною патогенезу нейродегенеративних розладів при інсультах. Отже, вісь «мікробіота кишечника-мозок» є двобічною комунікаційною мережею, однак досі залишається багато невизначених механізмів взаємодії її складових. Дослідження in vivo та in vitro показала, що ген c-fos, який кодує ядерний білок c-Fos, відіграє важливу роль у регуляції запрограмованої загибелі нейронів при інсультах. Однак його реакція у структурах мозку на порушення функціонального стану осі «мікробіота кишечника-мозок» при порушенні церебрального кровотоку на тлі дисбактеріозу залишається майже недослідженою.

Мета роботи – з’ясувати вплив неповної глобальної ішемії-реперфузії головного мозку на активність гена c-Fos (за вмістом продукту його кодування – білка c-Fos) у префронтальній корі та полі гіпокампа СА1 щурів із кишечним дисбактеріозом.

Матеріал та методи дослідження. Дослідження проведені на 40 статевозрілих щурах-самцях, розподілених на 4 групи: І – контроль; ІІ – каротидна ішемія-реперфузія головного мозку; ІІІ – дисбактеріоз; ІV – каротидна ішемія-реперфузія на тлі дисбактеріозу. Дисбактеріоз моделювали введенням цефтріаксону (АЦС Добфар СПА, Італія) раз на добу 14 днів, 300 мг/кг внутрішньом’язово. Неповну глобальну ішемію-реперфузію головного мозку моделювали двобічною оклюзією загальних сонних артерій протягом 20 хв. із подальшою одногодинною реперфузією, що дозволяє оцінити реакцію мозку у межах терапевтичного вікна при інсультах. Після цього під каліпсоловим наркозом (75 мг/кг) здійснювали декапітацію тварин, головний мозок швидко вилучали на холоді, згідно з координатами стереотаксичного атласу забирали префронтальну кору та гіпокамп і занурювали їх у розчин Буена. Використовуючи ротаційний мікротом робили серійні зрізи завтовщки 5 мкм, депарафінували їх у ксилолі, здійснювали регідратацію в низхідних концентраціях етанолу (100 %, 96 %, 70 %), відмивали у 0,1 М фосфатному буфері (pH 7,4) і обробляли моноклональними антитілами до c-Fos антигенних детермінант. Ідентифікацію c-Fos у гістологічних зрізах досліджуваних структур мозку здійснювали методом непрямої імунофлуоресценції, застосовуючи комп’ютерну систему цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (“Kontron Elektronik”, Німеччина) в ультрафіолетовому спектрі. Зображення за допомогою високочутливої відеокамери COHU-4722 (COHU Inc., США) вводили в комп'ютерну систему цифрового аналізу VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина) і оцифровували за денситометричною шкалою. Експериментальні втручання та евтаназію тварин здійснювали згідно з основними положеннями Конвенції Ради Європи про охорону хребетних тварин, що використовують в експериментах та інших наукових цілях, від 18.03.1986 р.; Директиви ЄЕС № 609 від 24.11.1986 р. і Наказу МОЗ України № 690 від 23.09.2009 р. Комісією з біоетики Буковинського державного медичного університету порушень морально-етичних норм при проведенні науково-дослідної роботи не виявлено (протокол № 5 від 16.12.2024). Отримані результати опрацьовані пакетом прикладних і статистичних програм VIDAS-2.5 (Kontron Elektronik, Німеччина), EXCEL з пакета MS Office 2007 (Microsoft Corp., США. Розраховували значення середньої арифметичної вибірки (М), її дисперсії і помилки середньої (m). Для виявлення достовірності відмінностей між показниками визначали коефіцієнт Стьюдента (t), ймовірність відмінності вибірок (р) і довірчий інтервал середньої. Критичний рівень значущості при перевірці статистичних гіпотез приймали рівним 0,05. Дослідження виконане у межах НДР «Механізми нейроімуноендокринної взаємодії, фактори ризику їх дизрегуляції та можливості фармакологічної корекції», реєстраційний номер 0124U002609. Термін виконання 12.2024 – 12.2028 рр.

Результати дослідження. Каротидна ішемія-реперфузія призводила до достовірного зростання усіх вивчених показників, що характеризують реакцію c-Fos-імунопозитивних нейронів префронтальної кори: щільність розташування c-Fos-імунопозитивних нейронів зросла на 25 %, сумарна площа флуоресценції (СПФ), площа флуоресценції, пов’язана з дифузною імунореактивністю (ПФДІ) у 64 та 9,5 рази відповідно. Характерно, що у цій зоні кори площа флуоресценції, пов’язана з клітинною імунореактивністю (ПФКІ) у тварин групи контролю не визначалася, що засвідчує відсутність активності гена cfos у клітинах у стані функціонального спокою. Однак ішемія-реперфузія призвела до активації цього показника, який сягав значень 2,959±0,601. Зросли також у цій структурі загальна концентрація білка cFos (Кc-Fos) і концентрація, пов'язана з дифузною імунореактивністю (Кc-FosДІ), у 93,8 та 10,8 раза відповідно. Водночас концентрація c-FOS білка, пов’язана з клітинною імунореактивністю (Кc-FosКІ), як і слід було очікувати, зважаючи на нульові значення ПФКІ, не визначалася, однак у постішемічному періоді вона становила 9,463±2,186 О_ІФ.  За цих же експериментальних умов у полі гіпокампа СА1 усі досліджені показники, що характеризують реакцію c-Fos-імунопозитивних нейронів, також перевищували контрольні: щільність розташування cFos-імунопозитивних нейронів на 25 %, СПФ, ПФДІ та ПФКІ – у 22,8, 22 та 23 рази, КcFos, Кc-FosДІ та Кc-FosКІ у 36,4, 12,5 та 54,33 раза відповідно.

У префронтальній корі та гіпокампі щурів із дисбактеріозом порівняно з показниками у групі контролю щільність розташування cFos-імунопозитивних нейронів була вищою на 14 та 35 % відповідно, значення СПФ і ПФДІ – у 24 та 9,9 раза та 18,3 і 26,6 раза відповідно; у корі визначена також ПФКІ, значення якої становило 0,751±0,258, у гіпокампі ж цей показник зріс у 14,8 раза щодо показника у тварин контролю. У корі встановлено також зростання Кc-Fos і Кc-FosДІ у 32,7 та 12,6 раза відповідно, а значення Кc-FosКІ становило (2,296±0,827; у гіпокампі параметри Кc-Fos, Кc-FosДІ та Кc-FosКІ стали вищими в 11,7, 8,9 та 13,9 раза.

Реакція c-Fos-реактивних нейронів на ішемію-реперфузію у щурів із дисбактеріозом була суттєвішою як порівняно з показниками після ішемії-реперфузії у щурів групи контролю, так і стосовно показників при дисбактеріозі: у префронтальній корі та гіпокампі щільність розташування c-Fos-імунопозитивних нейронів перевищувала на 21 та 11 % показники при дисбактеріозі та на 10 і 20 % – постішемічні значення у тварин без дисбактеріозу. СПФ, ПФДІ, ПФКІ, Кc-Fos, Кc-FosДІ та Кc-FosКІ у корі були вищими у 7,5, 2,9, 10,9, 8,38, 2,85 та 11,82 раза стосовно дисбактеріозу та у 2,8, 3,0, 2,8, 2,9, 3,3 та 2,9 раза відповідно щодо постішемічних показників без дисбактеріозу. У гіпокампі СПФ, ПФДІ, ПФКІ, Кc-Fos, Кc-FosДІ та Кc-FosКІ перевищували відповідні показники при дисбактеріозі у 4,2, 1,7, 6,2, 9,7, 5,8, 11,6 раза та показники при ішемії-реперфузії у контрольних тварин у 3,4, 2,1, 3,9, 3,1, 3,9 та 3,0 раза.

Висновки. 1. Гостре порушення церебрального кровотоку в басейні сонних артерій та кишечний дисбактеріоз мають односпрямований вплив на зміни с-Fos імунореактивності у префронтальній корі та полі гіпокампа СА1, збільшуючи як щільність розташування с-Fos нейронів, так і площу імунореактивності, однак при цьому спостерігаються кількісні відмінності, що залежать як від досліджуваної структури, так і експериментальної моделі.
2. Найсуттєвіше зростання вмісту білка с-Fos встановлено при моделюванні ішемії-реперфузії головного мозку на тлі дисбактеріозу. 3. При всіх експериментальних моделях зростання білка с-Fos відбувається переважно за рахунок підвищення його концентрації, а не збільшення кількості с-Fos-позитивних клітин.